文献速递 | 靶向NETs：治疗血液系统恶性肿瘤的新策略
2024年4月，陆军军医大学第二附属医院药学部刘容兴教授团队于《Biomed Pharmacother》（影响因子/JCR分区：6.9/Q1 ）杂志上发布了综述“靶向NETs：治疗血液系统恶性肿瘤的新策略”。
主要内容：
① NETs在癌症发展过程中扮演着双重角色，在结直肠癌（CRC）和头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）中，NETs通过诱导细胞凋亡、抑制癌细胞增殖和转移发挥抗肿瘤作用。然而，在肺癌（LC）、乳腺癌（BC）和骨髓增殖性肿瘤（MPN）中，NETs会促进肿瘤增殖和转移，表现出促癌特性，甚至加重感染；
② 在恶性血液病患者中，已发现不同的NETs表达与血液病的发展相关，如急性早幼粒细胞白血病（APL）、慢性淋巴细胞白血病（CLL）、小儿急性白血病（PAL）、骨髓增生性肿瘤（MPNs）、NPM1基因突变的急性髓性白血病（NPM1-AML）、淋巴瘤（ML）、多发性骨髓瘤（MM）；
③ 以NETs为药物靶点有望成为一种潜在的治疗干预手段，但目前正在进行临床试验的这些药物并非专门针对NETs的形成起作用，而是通过靶向中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）来抑制NETs异常降解的过程，或者选择性地降解形成NETs所必需的DNA纤维；
④ 西维来司他钠是第一个针对全身炎症反应综合征（SIRS）导致的急性肺损伤的治疗药物，是一种特异性NE抑制剂，储存在中性粒细胞颗粒内。据推测，将纳米颗粒介导的NE抑制剂应用于中性粒细胞可显著提高其治疗效果。Cruz等人证明了通过纳米颗粒介导的西维来司他钠递送能够有效抑制中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）的形成。
中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）已成为恶性血液病发病机制中的一个关键因素。这些由 DNA、组蛋白和细胞质蛋白组成的结构最初被认为在抵御微生物威胁的免疫防御中发挥作用。越来越多的证据表明，NETs有助于恶性细胞的发展和扩散，是一把双刃剑。然而，有关其参与血液病的报道却很少。要探索有效的治疗策略，就必须全面了解恶性细胞与NETs之间错综复杂的关系。本综述重点介绍了NETs的形成和疾病发病机制。此外，我们还讨论了用于选择性NETs破坏的靶向抑制剂开发方面的最新进展，从而为恶性血液病的精确设计和有效治疗干预提供了依据。
中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）是一种独特的免疫反应，由一种被称为中性粒细胞的白细胞亚群利用，以有效捕获和消灭入侵的病原体。NETs的形成与中性粒细胞核DNA的后续释放有关。这种DNA可作为招募和组织抗菌蛋白的框架，最终形成网状结构，有效地困住病原体。然而，这种复杂的网状结构具有双重功能，既能防御病原体，又能造成免疫系统损伤。
NETs的形成过程由一系列相继发生的事件组成。其中一个关键步骤是钙动员，它启动了 NETosis。随后，活性氧（ROS）被生成，以帮助消灭病原体，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶 2（NOX2）的催化等位体是中性粒细胞中主要的ROS生成物。髓过氧化物酶（MPO）活性和中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）释放也有助于核脱氧和中性粒细胞核破碎。此外，NETs的形成还涉及染色质解聚和组蛋白瓜氨酸化（特别是组蛋白H3（CitH3））等过程，以帮助染色质解聚。瓜氨酸化将精氨酸残基转化为瓜氨酸，这是由一组称为肽基精氨酸脱氨酶（PADs）的酶促成的。肽基精氨酸脱氨酶 4（PAD4）在该酶家族中尤为重要，它负责将组蛋白H3精氨酸位置2、8和17的瓜氨酸化。这种瓜氨酸化过程降低了染色质的正电荷，阻碍了组蛋白与DNA结合的能力。这种修饰对促进NETs的形成起着至关重要的作用（图1）。然而，PAD4 在NETs形成过程中的作用一直存在争议。目前的文献表明，抑制PAD4可有效减少NETs的形成。此外，对缺乏功能性PAD4的小鼠进行的实验研究也表明，PAD4的抑制可有效减少NETs 的形成。相反，其他研究表明，正常的NETs在没有功能性 PAD4 的情况下也会形成。因此，在PAD4的背景下调查NETs的释放似乎非常有必要，值得进一步研究。
图1 | NETs的形成。中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）的形成涉及钙、活性氧（ROS）、NADPH 氧化酶 2（NOX2）、髓过氧化物酶（MPO）和中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）的动员。此外，NETs的形成还涉及染色质解聚和组蛋白（尤其是组蛋白H3（CitH3））的精氨酸瓜氨酸化，这是由肽基精氨酸脱氨酶4（PAD4）催化的，从而导致CitH3瓜氨酸化。
NETs在癌症发展过程中扮演着双重角色，具体取决于特定的肿瘤微环境。在结直肠癌（CRC）和头颈部鳞状细胞癌中，NETs通过诱导细胞凋亡、抑制癌细胞增殖和转移发挥抗肿瘤作用。然而，在肺癌（LC）、乳腺癌（BC）和骨髓增殖性肿瘤中，NETs会促进肿瘤增殖和转移，表现出促癌特性，甚至加重感染（图 2）。NETs对疾病进展和发展的影响有多种机制。一方面，DNA纤维和相关蛋白的释放会产生特定的微环境，促进肿瘤细胞的增殖和存活。另一方面，NETs引发的炎症和组织损伤会刺激肿瘤生长、侵袭和转移。此外，已观察到NETs与癌细胞之间的直接相互作用会影响其粘附性，从而促进转移细胞向远处器官扩散。这些发现凸显了NETs对恶性血液病的重大影响，并强调了在这一领域开展进一步研究的必要性。
图2 | NETs的不同功能。左侧的中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）具有致癌作用，可诱导肿瘤形成并引发免疫失调。而右侧的中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）则能抵御肿瘤细胞的形成，并激活抗肿瘤因子。
血液恶性肿瘤中的NETs功能
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急性早幼粒细胞白血病（APL）
APL是急性髓性白血病（AML）的一种，其特征是骨髓中不成熟的白细胞（早幼粒细胞）异常增殖。APL由PML-RARA融合基因引起，该基因由15号染色体上的PML基因和17号染色体（q22;q21）上的RARA基因产生。全反式维甲酸（ATRA）和三氧化二砷（ATO）是APL的一线治疗方法，它们靶向PML-RARA融合基因，促进前骨髓细胞成熟为功能细胞。这一策略被认为是治疗APL最有效的常规方案。ATRA和ATO通过调节mTOR和核糖体蛋白S6激酶β-1（p70S6K）诱导自噬，导致致癌的PML-RARA蛋白降解，进而诱导APL细胞的粒细胞分化。此外，ATRA和ATO还能触发细胞外诱捕网（ETs）的释放，这是一种替代性细胞死亡途径，通过mTOR调控的自噬作用进行协调（图 3）。ATRA诱导的自噬依赖于自噬相关蛋白（ATG），而ATO诱导的自噬主要依赖于BECN1。因此，在ATRA和ATO治疗APL期间，ETosis可在提高存活率方面发挥重要作用。
图3 | ATA /ATRO在治疗APL中的作用。ATA和ATRO通过mTOR和p70S6K调节自噬蛋白ATG和BECN1，诱导自噬增加，从而引发ETosis，诱导APLL细胞凋亡。
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慢性淋巴细胞白血病（CLL）
CLL是一种由异常增殖和成熟淋巴细胞聚集引起的单克隆疾病。它主要影响骨髓、血液和淋巴结。通常，CLL 和套细胞淋巴瘤（MCL）被认为是原发性B细胞淋巴增生性疾病（LPD），通常与CD5阳性有关。
对CLL的研究表明，与年龄相仿的健康人相比，从CLL患者体内分离出的中性粒细胞具有更高的释放NETs的倾向。NETs生成的增加并不是由于弹性蛋白酶、MPO或ROS生成水平的增加，而是受血浆IL-8的影响。此外，研究还发现NETs能延缓CLL患者B细胞的自发凋亡，并增强激活标志物（如成本刺激分子和CD69）的表达。这些重要发现为了解CLL固有的错综复杂的免疫失调提供了新的视角，并为确定治疗这种令人困惑的恶性肿瘤的靶向疗法开辟了前景广阔的途径。
Sangaletti等人的一项CD5+ B细胞慢性淋巴细胞白血病研究揭示了富含半胱氨酸的分泌型酸性蛋白（SPARC）、NETs和中性粒细胞上的免疫抑制受体LIR-1激活之间的相互联系。缺乏lpr/Sparc的小鼠脾脏中的中性粒细胞表现出B细胞活化因子生成增强和NETs形成倾向。此外，NETs通过NF-kB激活刺激CD5+ B细胞增殖。lpr/lpr/Sparc-/-小鼠的NETosis增加依赖于细胞外基质（ECM）抑制信号的减少。这些发现为CD5+ B细胞慢性淋巴细胞白血病的发生提供了一种新的机制。
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小儿急性白血病（PAL）
PAL是一种影响血液和骨髓细胞的癌症。其 “急性 ”的命名突出了疾病进展迅速，需要及时的医疗干预。急性白血病通常是一种儿科疾病，主要是急性B淋巴细胞白血病和T淋巴细胞白血病，还有一些急性髓性白血病。
Ostafin等人在一项比较研究中对急性白血病进行了评估，与健康对照组儿童相比，急性白血病患儿中性粒细胞释放NETs的能力下降。被诊断为急性白血病的儿童面临着一个独特的挑战，其特点是NETs释放受损，这一现象与在成人身上观察到的不同。这种NETs释放障碍在诊断时和整个治疗过程中都会持续存在。因此，这些儿童发生感染性并发症的风险增加。重要的是，恢复正常的中性粒细胞功能取决于白血病的成功治疗。这些发现强调了NETs作为小儿急性白血病特异性诊断指标的潜力。此外，以NETs为特异性靶点可为治疗急性白血病提供一种前景广阔的治疗策略。
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骨髓增生性肿瘤（MPNs）
MPNs是一系列克隆性骨髓疾病的总称。它们根据是否存在费城染色体进行分类，分为费城染色体阳性（Ph+）组和费城阴性（Ph-）组。CML是多发性骨髓瘤的一个子集，其特征是存在费城染色体，并以BCR-ABL1融合基因为标志。相反，费城阴性多发性骨髓瘤包括一组疾病，包括真性多血细胞增多症（PV）、原发性血小板增多症（ET）和骨髓纤维化（MF）。
据观察，与健康人相比，CML患者的中性粒细胞更容易形成NETs。此外，CML患者循环中的NETs水平显著升高，表明NETs不断释放到血液循环中。骨髓增殖性肿瘤是一种异质性血液系统恶性肿瘤，其特点是由于JAK-STAT信号通路的构成性活性导致髓系细胞的克隆性和非调控性增殖。嗜酸性粒细胞白血病可能会通过建立促炎病理微环境对造血疾病产生影响，而这种微环境可以维持造血前体的增殖。幸运的是，人们发现药物ruxolitinib（JAK2抑制剂）可以减少NETs的过度生成。研究还表明，MPN患者体内NETs的存在与ROS和MPO-DNA 的生成有关，MPN患者的血小板容易与中性粒细胞结合并激活中性粒细胞，导致NETs的形成，而N-乙酰半胱氨酸（NAC）可抑制NETs的形成。这些研究提供了新的诊断指标，并扩大了现有的治疗方案。
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NPM1基因突变的
急性髓性白血病（NPM1-AML）
AML是一种流行的白血病亚型，主要影响成年人，约占所有病例的 80%。这种恶性疾病发生在骨髓中，尤其影响造血前体，并在发育早期阻碍其进展。NPM1突变是急性髓细胞性白血病中常见的分子异常，对疾病预后有重大影响。近来治疗指南的进步有助于提高不同年龄组的治愈率。具体而言，60岁以上患者的治愈率显著提高，最高可达15%。与此同时，60岁以下患者的治疗效果也有所改善，治愈率约为40%。然而，尽管在治疗方面取得了这些进步，但老年人的预后仍然相当不利。
骨髓转化细胞可向细胞外空间释放NETs，从而激活凝血接触系统或维持骨髓增殖。值得注意的是，NPM1基因突变的急性髓细胞性白血病患者骨髓中细胞外诱捕网富集明显。Tripodo 等人采用了一种独特的转基因小鼠模型，证明不仅中性粒细胞，白血病细胞也被观察到在细胞外释放含有白血病相关抗原的捕集网，包括特征性突变的核磷蛋白（NPMc+）。这种突变蛋白会从核仁重新定位到细胞质，在那里它会聚集在核孔复合体的丝状结构上。深入研究证实，NPMc+ NETs/DC（基于NETs的树突状细胞）疫苗可以克服对突变NPM的抗药性，并在没有接种AML疫苗或携带者的NPMc+ Tg小鼠中促进强大的细胞毒活性。此外，NETs疫苗接种可刺激CD8 T细胞产生抗肿瘤免疫诱导反应，同时产生NPMc特异性抗体。这种开创性的急性髓细胞性白血病治疗疫苗是一种基于NETs的新型治疗方法，它在白血病爆破细胞中的应用展示了一项重大创新。
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淋巴瘤（ML）
ML是一种起源于淋巴结和淋巴组织的免疫恶性肿瘤。其发生主要是由于免疫反应过程中淋巴细胞增殖产生的免疫细胞的致癌转化。淋巴瘤主要分为霍奇金淋巴瘤（HL）和非霍奇金淋巴瘤。霍奇金淋巴瘤（HL）是一种起源于生殖中心的B细胞肿瘤，可分为两大亚型：典型型和结节性淋巴细胞优势型。典型霍奇金淋巴瘤（cHL）是最常见的亚型，表现为结节性硬化（NS cHL）。另一种亚型，即弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBCL），是非霍奇金淋巴瘤的主要形式。
对淋巴瘤和NETs的研究表明，血浆和肿瘤组织中NETs的升高与DLBCL患者的不良预后有关。其主要机制是来自DLBCL的IL-8与中性粒细胞上的受体（CXCR2）相互作用，通过Src、p38和ERK等信号通路形成NETs。新形成的NETs直接上调DLBCL的Toll样受体9（TLR9），随后激活NFκB和STAT3通路，最终促进肿瘤进展（图4）。
图4 | DLBCL患者的NETs发病机制。DLBCL患者体内产生的IL-8通过其受体（CXCR2）作用于中性粒细胞，通过Src、p38和ERK等信号通路形成NETs。NETs的形成会上调Toll样受体 9（TLR9），随后激活NFκB和STAT3通路，从而诱导DLBCL。
值得注意的是，有关NETs和霍奇金淋巴瘤的研究提供了证据，证明NETs参与了经典霍奇金淋巴瘤（特别是结节硬化亚型（NS cHL））的炎性肿瘤微环境。NS cHL中NETs的形成表明肿瘤组织中存在NETosis所需的信号。中性粒细胞的活化可通过一系列受体启动，包括Toll样受体（TLR）、Fc受体、细胞因子受体、补体受体以及白细胞介素-8（IL-8）、肿瘤坏死因子（TNF）和干扰素-γ（IFN-γ）等细胞因子，所有这些都能诱导NETs形成。据报道，这些分子在cHL中大量存在，并可能通过多种机制协同激活NETs释放。
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多发性骨髓瘤（MM）
MM是一种主要影响骨髓微环境的血液恶性肿瘤，其特征是浆细胞的异常生长。与健康人通过正常产生抗体来对抗感染不同，多发性骨髓瘤中的癌浆细胞会破坏免疫系统的功能。这种有害后果源于异常蛋白质的过度产生，损害了免疫反应，并引发并发症，降低了患者的整体健康水平。
在关于NETs与MM之间关系的研究中，暴露于MM细胞的中性粒细胞组蛋白H3瓜氨酸化的升高与NETs的形成密切相关。令人震惊的是，当MM细胞与缺乏PAD4酶的中性粒细胞共同培养时，这种反应无效，从而证实了PAD4在MM诱导的NETs形成中起着不可或缺的作用。由此可见，组蛋白 H3 瓜氨酸化是NETs形成的关键因素，而PAD4则是整个过程的媒介。相关治疗研究结论是，用BMS-P5抑制PAD4阻断了MM诱导的NETs形成，并使用新的PAD4特异性同基因小鼠中的抑制剂BMS-P5。详细描述BMS-P5将随后提供。
与NETs有关的药物化合物
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PAD4抑制剂：BMS-P5和JBI-589
肽基精氨酸脱氨酶（PADs）是一种催化肽基精氨酸脱氨酶的酶。这种修饰可通过去甲基化或脱甲基化过程发生，并形成瓜氨酸。PAD家族由五个成员（PAD1-4和PAD6）组成，它们由不同的基因编码，具有不同的组织表达模式和底物特异性。PAD4是PAD酶家族中唯一具有核定位序列的成员。它与其他酶（如精氨酸甲基转移酶）竞争，后者通过进行瓜氨酸化对组蛋白H3和H4中的多个精氨酸残基进行修饰。瓜氨酸化组蛋白H3与NETs的形成有关。因此，这一连续事件强调了在与NETs过度形成相关的各种病理条件下靶向PAD4的潜力。
Li等人研究了新型PAD4抑制剂[（2 S, 5 R）-5-氨基-2-甲基-1-哌啶基][2-[1-（环丙基甲基）-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-7-甲氧基-1-甲基-1-H-甲酮（BMS-P5）的性质和潜在应用（图5）。在人类MM细胞系中应用 BMS-P5证明了其减少NETosis发生的潜力。此外，BMS-P5还能阻碍MM患者原代骨髓细胞中 NETs的形成。与此同时，经过基因修饰的MM小鼠模型在接受BMSP5治疗后也有明显改善。BMS-P5可缓解MM症状，延长小鼠存活时间。此外，与未接受BMS-P5治疗的小鼠相比，接受BMS-P5治疗的小鼠体内MM细胞的比例和绝对数量均明显减少。深入研究发现，在BMS-P5治疗的小鼠模型中，DNA和CitH3（NETs的主要成分）明显减少（表 1）。
图5 |与中性粒细胞外诱捕网（NETs）相关的抑制剂的化学结构。中性粒细胞外诱捕网阱（NETs）抑制剂及其各自的结构。
表1|与NETs相关的药物化合物
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氯喹
氯喹是一种重要的氨基喹啉化合物，已被广泛用于各种疾病的临床治疗，包括疟疾、肝阿米巴病、红斑狼疮、光敏性皮肤疹和类风湿性关节炎。甚至抑制血小板聚集也能有效预防血栓形成。这种多用途化合物具有喹啉结构，在第四和第七位发生了取代：第四位是[5-（二乙基氨基）戊-2-基]氨基，第七位是氯（图 5）。这些结构修饰极大地促进了氯喹的广泛治疗潜力。
如前所述，NETs与自身免疫性疾病中的血栓形成和无菌性炎症密切相关。在小鼠胰腺腺癌中，中性粒细胞显示出更强的NETs形成倾向，而小鼠服用氯喹后，NETs的形成受到阻碍。相反，研究发现氯喹可以减少NETs诱导的血小板聚集和组织因子释放（表 1）。这一突破性发现表明，氯喹能显著抑制NETs的形成，从而为血液病的治疗提供了一种前景广阔的治疗方法。
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氢气
氢气疗法被认为是一种潜在的治疗方法，可减轻 COVID-19 早期由 SARS-CoV-2 引起的破坏性细胞因子风暴和肺损伤。据推测，氢气疗法可通过降低炎症期间的粘附性来刺激粘稠痰液的清除。反过来，氢气有可能加快肺部炎症的消退。
Shirakawa 等人的一项研究收集了健康人的中性粒细胞。这些中性粒细胞受到两种不同制剂的刺激，即12-carnitate-13-acetate（PMA）磷酸盐和钙离子电泳 A23187。这种刺激是在氢气暴露和未暴露的介质中进行的。研究的主要目的是比较受刺激的中性粒细胞与对照组中性粒细胞的行为反应，尤其是暴露于氢气中的中性粒细胞。与对照组相比，暴露于氢气中的中性粒细胞在PMA或A23187的刺激下会减少聚集、降低组蛋白精氨酸甲基化、破坏染色质复合物并释放NETs成分。此外，氢气还抑制了H2AX Ser-139磷酸化，这对DNA修复有影响，因为H2AX是一种损伤指示剂，可阻碍CXCR4的表达。氢气在抑制髓过氧化物酶的氯化活性和产生活性氧方面的作用与N-乙酰半胱氨酸和抗坏血酸相似。相反，当PMA刺激中性粒细胞时，氢气在抑制NETs形成方面的功效优于其他抗氧化剂（表 1）。
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纳米颗粒介导的西维来司他钠给药系统
纳米颗粒已成为向细胞靶向给药的一种有前途的策略，旨在提高精确性并降低全身毒性。西维来司他钠 (ONO-5046), N-{2-[4-（2,2 -二甲基丙酰氧基）苯基磺酰氨基]苯甲酰}氨基乙酸（图 4）是第一个针对全身炎症反应综合征（SIRS）导致的急性肺损伤的治疗药物，是一种特异性中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）抑制剂，储存在中性粒细胞颗粒内。据推测，将纳米颗粒介导的NE抑制剂应用于中性粒细胞可显著提高其治疗效果。Cruz等人证明了通过纳米颗粒介导的西维来司他钠递送能够有效抑制中性粒细胞胞外网（NETs）的形成。他们观察到肺损伤样本的临床指标明显下降，包括血清NE和其他促炎细胞因子的下降（表 1）。此外，使用纳米颗粒介导的西维来司他钠治疗的小鼠可有效防止内毒素休克。基于纳米粒子的NE抑制剂（如西维来司他钠）递送策略为治疗NETs驱动的疾病提供了一种有趣的新型潜在治疗干预手段。
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外源性前列腺素E2 （PGE2）
前列腺素 E2（(5Z, 11a, 13E, 15 S)-11, 15-二羟基-9-氧代前列腺素-5, 13-二烯-1-酸；PGE2；地诺前列酮）是一种内源性前列腺素，常用作药理制剂（图 5）。PGE2具有催产特性，在临床上被广泛用于各种用途，如促进流产、控制产后出血、治疗妊娠滋养细胞疾病和维持新生儿动脉导管通畅。PGE2 还可用于患有先天性心脏缺陷的新生儿，作为手术干预可行前的临时措施。在对接受自体和异体造血干细胞移植的患者进行的研究中，发现PEG2可阻碍小鼠和人类NETs的形成。这种抑制作用主要通过EP2和EP4受体，由蛋白激酶A和Epac介导。此外，PEG2 还能通过诱导中性粒细胞的自噬作用有效限制NETs的释放。从另一个角度看，这些发现凸显了PEG2对NETs形成和释放的深远影响（表 1）。
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SOCE（钙池操纵性钙内流） 抑制剂：
2-APB
对活性氧（ROS）的研究发现，活性氧的产生与贮存操作Ca2+进入（SOCE）之间存在显著联系。这种关系在多形核中性粒细胞（PMN）形成NETs的过程中至关重要。二苯硼酸2-氨基乙基酯（2-APB）作为一种SOCE抑制剂具有显著的活性（图 5）。
一项探索人类精子的引人入胜的研究揭示，精子能够有效地引发NETosis（细胞外网化裂解），而2-APB的治疗能够抑制这一过程。由精子引发的NETosis对精子膜完整性和顶体（精子头部的突起结构）有负面影响，导致卵子的结合能力下降。SOCE（钙库内钙离子释放通道）抑制剂能够阻止NETs的形成，从而改善精子功能并增强卵子的结合能力，最终提高受孕率。这在治疗不孕症方面具有重要意义（表 1）。
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BTK/ATK 抑制剂：伊布替尼
伊布替尼通过选择性靶向布鲁顿酪氨酸激酶（BTK）蛋白并与之结合，阻碍B细胞的增殖和存活，从而发挥治疗作用。这种机制可有效阻断B细胞恶性肿瘤中经常出现的异常活跃的B细胞受体通路。因此，伊布替尼已成为治疗各种B细胞癌症（包括套细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病和Waldenstrom's巨球蛋白血症）的重要选择。伊布替尼是丙烯酰胺亚类，具有 (3 R)− 3-[4-氨基-3-(4-苯氧基苯基) 噻唑并[3， 4-d]嘧啶-1-基]哌啶结构，其中哌啶氮被丙烯酰基取代（图 5）。
对健康供体和CLL患者外周血中的中性粒细胞和γδ T细胞进行的研究发现，伊布替尼具有抑制γδT 细胞活化和CD107a脱颗粒的能力。此外，它还能通过减少NETs形成、ROS 生成和杀菌能力来影响中性粒细胞。Florence等人研究了受甲型流感病毒感染的小鼠肺部炎症和呼吸衰竭的情况。在这些研究中，服用伊布替尼减轻了严重流感感染诱发的急性肺损伤的不良后果。这种保护机制是通过调节向肺部环境释放的NETs来实现的（表 1）。根据以往的研究，伊布替尼作为一种靶向治疗药物显示出良好的疗效。此外，已观察到伊布替尼具有调节NETs释放的能力，从而提供额外的抗菌功能。
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内源性丝氨酸蛋白酶抑制剂：
SerpinB1和SLPI
SerpinB1（白细胞弹性蛋白酶抑制剂，LEI；单核细胞/中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂，MNEI）是属于丝氨酸蛋白酶家族的丝氨酸蛋白酶抑制剂。丝氨酸蛋白具有独特的三级结构，利用类似自杀底物的机制使靶蛋白酶失活（图6A）。在人类中，血清素分为九个支系（A 至 I）。SerpinB1 被认为是一种特别有效的 NE 抑制剂。它主要在巨噬细胞和中性粒细胞中表达，并在细胞质和中性粒细胞颗粒中大量积聚。值得注意的是，SerpinB1 缺乏信号肽，不会按照传统的分泌途径向细胞外释放。Farley 等人对感染铜绿假单胞菌的小鼠支气管肺泡灌洗液（BALF）进行了广泛分析，观察到 SerpinB1水平下降与NETs生成增加之间存在负相关。重组SerpinB1能有效破坏体外激活的中性粒细胞中NETs的形成。此外，大量证据支持 SerpinB1 通过调节NE介导的染色质去浓度来抑制NETs的观点（表 1）。
SLPI是一种典型的丝氨酸蛋白酶抑制剂，它通过外露的结合环与蛋白酶结合。该结合环的构象与酶的活性位点高度互补（图 6B）。SLPI主要储存在继发性中性粒细胞颗粒中，存在于各种分泌物中，包括分泌血浆、宫颈粘液和支气管分泌物，对胰蛋白酶、白细胞弹性蛋白酶和酪蛋白酶G有很高的亲和力。SLPI的抑制特性在免疫反应中发挥了重要作用，可保护上皮表面免受内源性蛋白水解酶的攻击。此外，这种特殊的抗菌蛋白还具有显著的抗菌、抗真菌和抗病毒特性。尽管SLPI对多种蛋白酶都有抑制作用，但它的主要功能似乎是抑制NE。SLPI与NE的复合物是其他复合物中最强的，从而确定了SLPI是中性粒细胞胞质中NE的抑制剂。SLPI被认为是中性粒细胞胞质中NE的主要抑制剂。然而，也有报告表明，SLPI的行为与NE相似，在中性粒细胞的刺激下，它可能会在不同细胞区之间迁移。因此，SLPI在细胞膜或特定颗粒中的存在可能表明中性粒细胞处于不同的活化状态（表 1）。
图6 |基于蛋白质的抑制剂及其结构。A：SERPINB1（UniProt ID：P30740）包含379个氨基酸，其CARD结合基序位于351至379 位（蓝色显示）；B：SLPI（UniProt ID：P03973）由132个氨基酸组成。SMART分析显示SLPI中存在两个WAP结构域，分别位于31至76位（棕色标记）和85至130位（红色标记）；710个氨基酸的LTF 蛋白。使用SMART数据库确定了两个TR-FER结构域，位于25 - 363位（黄色突出显示）和364 - 699位（紫色突出显示）。
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乳铁蛋白 （LF）
LF是一种乳清蛋白成分（存在于多种哺乳动物的乳汁中），由单链多肽组成，具有两个球状裂片（图 6C）。LF具有很强的抗蛋白水解能力。这种多功能蛋白质具有多种优势特性，包括可作为抗病原、抗癌、抗炎、免疫调节和DNA调节剂，因此被公认为一种杰出的分子。
细胞研究表明，在可溶性免疫复合物的刺激下，乳铁蛋白能以剂量依赖的方式抑制NETs 的释放。此外，乳铁蛋白还能有效阻止DNA释放到体外培养基中。在III型超敏反应小鼠模型中，使用LF 治疗后，NETs纤维减少，从而抑制了免疫复合物诱导的NETs形成。LF因其N 端带正电荷的残基与带负电荷的DNA分子之间的静电相互作用而主动结合DNA的能力已得到广泛认可。总之，乳铁蛋白中的精华氨基酸序列之间的相互作用以及与NET-DNA的电荷-电荷相互作用（表 1）对抑制NETs的形成有重大影响。
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利拉鲁肽（GLP-1）
GLP-1是胰高血糖素样肽（GLP-1）的类似物，属于新型抗糖尿病药物，因其能够在高血糖时选择性地诱导胰岛素分泌（胰岛素增量素）而闻名。利拉鲁肽提取自内源性人类 GLP-1（7-37位），并进行了两种必要的修饰：用精氨酸取代第34位上天然存在的赖氨酸氨基酸残基，并添加棕榈酸分子。棕榈酸分子与第26位赖氨酸的ε-氨基结合，中间有谷氨酸间隔。
在肺癌和肝癌小鼠模型中对利拉鲁肽的研究发现，利拉鲁肽能显著减少循环中的NETs标记物，如Lewis肺癌（LLC）和Hepa1-6肿瘤小鼠体内的髓过氧化物酶、弹性蛋白酶和dsDNA。利拉鲁肽能抑制ROS，从而下调肿瘤微环境中中性粒细胞的NETs。研究还发现了利拉鲁肽与PD-1抑制剂在LLC和Hepa1-6肿瘤中的潜在协同作用。研究发现，利拉鲁肽能增强PD-1抑制的疗效并减少肿瘤生长（表 1）。
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Alveofact和Curosurf
表面活性物质替代疗法是治疗呼吸窘迫综合征的一种标准且广泛使用的疗法。表面活性剂分为天然和合成两大类。Alveofact和Curosurf是广泛使用的动物源表面活性剂。在现有的药物产品中，Alveofact是一种值得注意的脂肪提取物，来源于牛肺灌洗液，含有较高浓度的表面活性蛋白 B（SP-B）和表面活性蛋白 C（SP-C）。Currosurf是一种从猪肺提取物中提取的肺表面活性物质，经过氯仿/甲醇和液体凝胶过滤色谱法纯化。它具有最高的磷脂（PL）含量、最小的粒度分布和最高的磷脂前体含量。
Schulz等人采用磁珠细胞分拣技术从健康人的外周血中分离出中性粒细胞。用Alveofact和Curosurf处理这些中性粒细胞，然后使用吸光度和荧光测定法定量测量NETs特异性蛋白 NE、MPO和无细胞DNA的水平。两种表面活性剂对NETs 的形成都有剂量依赖性的抑制作用。具体来说，Alveofact和Curosurf 用量的增加会降低NE、MPO和cit H3 的水平（表 1）。
与NETs有关的天然产物
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姜黄素
姜黄素（C21H20O6）是一种多酚化合物，具有很强的生物学活性，天然存在于姜黄（一种从姜黄根茎中提取的香料）中。几个世纪以来，姜黄一直是具有药用价值的主要成分。姜黄素是一种对称分子，由三个不同的化学单元组成：两个包含邻甲氧基酚基的芳香环系统，由一个具有α、β-不饱和β-二酮分子的七碳连接体连接。这种分子以同分异构的二酮形式存在，在有机溶剂中以烯醇形式为主，而在水中则以酮形式为主。这种二酮结构可以形成稳定的烯醇，并很容易被去质子化，生成烯醇盐。化合物中的α、β-不饱和羰基是一种极好的迈克尔反应受体，很容易发生亲核加成反应，形成加合物（图 5）。
在肝脏缺血再灌注损伤（IRI）小鼠模型中应用姜黄素，可缓解肝脏IRI并减少中性粒细胞浸润，从而达到保肝效果。姜黄素通过抑制MEK/ERK通路抑制了NETs并改善了肝IRI。此外，姜黄素还能改善多溴联苯醚（PBDE-47）的毒性，这是因为姜黄素通过PBDE-47阻碍了NETs的释放。这一抑制过程也调节了Nrf2相关的ROS活性（表 1）。根据上述观察结果，天然物质显然具有对NETs介导的发病机制进行治疗干预的潜力。
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F -夹竹桃麻素和柚皮苷
F -夹竹桃麻素（4-氟-2-甲氧基苯酚）是一种天然有机化合物，在结构上与香兰素有关，与柚皮苷相比具有更强的效力，后者用于抑制 NOX2 活性（引言中强调了NETs与 ROS 以及 NOX2 之间的相关性）。柚皮苷是一种黄酮苷，在葡萄柚和橙子的果皮中含量相当高。这种化合物可以抑制 P38 丝裂原活化蛋白激酶（P38MAPK）信号通路（表 1）。P38MAPK 在激活中性粒细胞酶和染色质修饰方面起着关键作用。这两种天然产物的确切结构如图 5 所示。
Arumugam 等人向丙烯醛诱导的肝脏 IRI 小鼠注射了F -夹竹桃麻素和柚皮苷，它们抑制了丙烯醛相关的NETs释放。此外，这两种化合物还能抑制炎性细胞因子的表达，激活 P38MAPK-ERK 并促进细胞凋亡。随后的研究发现，在丙烯醛诱导的肝脏 IRI 模型中，F -夹竹桃麻素和柚皮苷可抑制NETs，这可能是由于调节组蛋白 3 瓜氨酸化和抑制趋化因子的产生（表 1）。
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受天然产物启发：四氢异喹啉
四氢异喹啉（THIQ；C9H11N）是一种通过异喹啉氢化反应获得的有机仲胺（图 5）。该物质为无色粘稠液体，可与各种有机溶剂混合。THIQ框架主要存在于多种生物活性化合物和药物中。
Martinez等人在筛选了8407种天然产品后，发现 THIQs 是一类小分子NETs形成抑制剂（在相对较低的微摩尔浓度下具有活性）。此外，在对系统性红斑狼疮（SLE）患者外周血进行的实验中观察到，THIQs不仅能抑制NETs的形成，还能阻碍下游ROS的产生，而对 MPO 没有任何影响（表 1）。用THIQ培养中性粒细胞时没有观察到细胞毒性，这一点通过测量培养基中的乳酸脱氢酶水平得到了证实。
临床试验
目前正在进行临床试验的这些药物并非专门针对NETs的形成起作用，而是通过靶向NE来抑制NET异常降解的过程，或者选择性地降解形成NETs所必需的 DNA 纤维。无论是在间接还是直接影响NET形成的过程中，这些药物都为与NETs相关的疾病提供了直接的实验依据。
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α-1抗胰蛋白酶Prolastin-C
α-1抗胰蛋白酶（AAT）是一种丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族成员。在人类中，AAT由 SERPINA1编码，它产生一种由394个氨基酸组成的单体糖蛋白（成熟形式）。AAT在三个连接的糖基化位点上表现出多种多样的糖基化残基，具有不同的结构模式，主要配备有二年生 N-聚糖。AAT是一种高效的蛋白酶抑制剂，对多种蛋白酶（除胰蛋白酶抑制外）都有抑制作用。作为一种酶抑制剂，AAT保护组织免受炎症细胞中的酶，特别是NE和蛋白酶3（PR3）带来的有害影响，这意味着AAT的主要功能是抑制NE和PR3。然而，血液中AAT含量不足或功能受损与NE对弹性蛋白的异常降解有关。这一降解过程导致肺弹性逐渐下降，从而引发呼吸系统疾病，如慢性阻塞性肺病（COPD）和其他成人肺部疾病。事实上，Prolastin-C作为一种AAT抑制剂，正在进行临床安全性和有效性试验，重点是确诊为支气管扩张的患者。最终目标是确定是否有令人信服的证据支持这种治疗剂广泛应用于治疗各种疾病（表 2）。
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人类DNaseⅠ酶：
阿法链道酶（Pulmozyme）
NETs是一种公认的结构，当它与DNA同时存在时，会对痰液粘度产生功能性影响。在这种情况下，人脱氧核糖核酸酶 I（rhDNase）的重组变体阿法链道酶（pulmozyme）已被用于选择性地靶向降解DNA。新近的研究支持这种重组酶在治疗囊性纤维化方面的优势作用。
阿法链道酶还能减轻COVID-19患者的肺部炎症。为了阐明这一观察结果背后的机制，研究人员进行了体外NETosis模拟，结果形成了细胞外DNA片段、红细胞、淋巴细胞和中性粒细胞簇。然后将阿法链道酶应用于成人单核细胞，研究其对细胞上清液数量和活力的影响。值得注意的是，阿法链道酶能有效清除捕获了许多单核细胞的NETs。Cortjens等人利用牛呼吸道上皮细胞感染严重呼吸道合胞病毒（RSV）的小鼠模型，该模型具有中性粒细胞炎症伴随NETs形成和（轻微）气道阻塞的特征。该模型类似于在患有严重RSV下呼吸道疾病（LRTD）的儿童身上观察到的组织病理学特征。因此，该模型能有效模拟人类的感染过程。在使用阿法链道酶治疗后，对动物模型肺组织进行的免疫组化分析表明，小鼠呼吸道内的NETs数量显著减少。因此，在牛RSV诱导的LRTD中，服用阿法链道酶可减轻气道阻塞（表 2）。如果阿法链道酶具有治疗恶性血液病的潜力，那么恶性血液病引起的肺部感染也可以同时治愈。这种双重益处使阿法链道酶成为治疗患有这两种疾病的患者的一种很有前景的治疗选择，它的优势在于一次干预就能实现两种治疗目标。
表2|在临床试验中，与NETs颗粒蛋白或释放的DNA纤维相关的药物
结论与展望
对中性粒细胞胞外捕获物（NETs）的最初观察可追溯到2004年。NETs由中性粒细胞挤出的染色质纤维组成，这些纤维被颗粒衍生的抗微生物肽和酶修饰，如中性粒细胞弹性蛋白酶、组织蛋白酶-G和髓过氧化物酶（MPO）。这些结构在固定和杀死入侵微生物方面起着至关重要的作用。随后的研究证实，NETs参与了自身免疫性和炎症性疾病，包括肾小球肾炎、慢性肺病、败血症、血管疾病和癌症。过度的NETosis或NETs清除能力受损可能会增加对NETs成分产生自身免疫反应的风险。同样，NETs也被认为是血液系统恶性肿瘤的诱因，是促进血液系统疾病发病的致癌因素。因此，NETs是一种双重现象，既是一种有效的抗微生物防御机制，同时又会引发恶性肿瘤和自身免疫反应。
NETs在癌症中的功能并不仅仅局限于微生物夹带。它们与癌症进展、转移以及静脉血栓栓塞等并发症有关。在恶性血液病患者中，已发现不同的NETs表达与血液病的发展相关。这一特殊现象对治疗反应和预后都有重大影响。因此，以NETs为药物靶点有望成为一种潜在的治疗干预手段，而NETs的存在也可作为诊断癌症和预后的重要生物标志物。
针对NETs的药物研究主要集中在消炎药和抗菌药上，如乙酰水杨酸、环孢素A、氯霉素、阿奇霉素和红霉素。然而，未来从天然产品中提取和合成更多的NETs抑制剂的努力将大有裨益，尤其是在利用纳米技术或重组蛋白开发可治疗肿瘤和调节炎症免疫微环境的 NETs靶向疗法的同时。
